實驗室生物安全

一、人類曆史上的重大疾病

公元前430年的雅典發生了鼠疫疫情，鼠疫也稱黑死病、腺鼠疫、腹股溝淋巴結鼠疫，是由鼠疫耶爾森氏鼠疫杆菌引起的甲類傳染病。到14世紀，歐洲大陸發生鼠疫大流行，1/4人口（約2500萬）病死。霍亂是由霍亂弧菌引起的急性腸道甲類傳染病。漢朝前就有記載，全世界共有7次大流行。其中1817年到1923年間的6次大流行，僅印度死者就超過3800萬。公元前412年的古希臘時期至今，共發生了31次流感大流行，其中1918年至1920年的“西班牙流感”，在全球範圍内造成了2000萬～4000萬人死亡。

除此之外，天花病、麻風病、艾滋病、炭疽病、各型肝炎和SARS等傳染病也給世界許多國家的社會、經濟和人員造成巨大的災難和損失。因此世界各國和各個世界衛生組織均在開展實驗室研究，探尋控制傳染病的方法。

二、實驗室曆史上的感染事件

在實驗室開展高緻病性病原微生物的研究，就有可能發生職業暴露而導緻實驗室感染。1886年科霍第一次報告了一例霍亂病的實驗室感染事件。受害者是德國柏林的一名學生，他在處理霍亂弧菌培養物時遭到感染，并得了霍亂病。有關實驗室感染的統計報告，最早見于1951年美國醫學雜志上，列出美國實驗室感染的1342個病例，感染涉及69種不同的微生物。值得注意的是其中1275例是在1930年以前發生的，那時很多人不注意生物安全的問題。

1979年4月，前蘇聯斯維爾德洛夫斯克生物武器實驗室發生洩露事故，約10公斤的炭疽芽孢粉劑洩漏，爆炸釋放出大量的毒霧，造成附近1000多人發病，數百人死亡。這是典型的事例。最常見的實驗室感染見于乙肝病毒，第一例肝炎的實驗室感染報告是在1931年由芬德利報道的，客觀上有大量的乙肝病毒實驗室感染事實存在。根據我國北京第二傳染病醫院孫孚報告（1987），在該醫院246名職工調查中，發現乙型肝炎病毒感染者141人，而檢驗科職工的感染例數，在18個不同科室中占第5位。 還有可怕的人類免疫缺陷病毒（HIV），1993年12月美國CDC報告了17名實驗室技術人員因職業而發生的HIV感染，而且有15名可能是在美國發生的。經皮穿刺接觸是導緻傳染的原因。

近期則有3起由SARS冠狀病毒引起的實驗室感染事件。2003年12月5日台灣國防部醫學院預防研究所一位中校,在本所BSL-4實驗室被感染;2004年9月8日，新加坡國立大學微生物實驗室的一名博士後研究生,在環境衛生研究院實驗室被感染；2004年4月27日北京一個國家級病毒病研究機構，一名安徽大學研究生被感染。

三、實驗室感染的危害性

北京SARS冠狀病毒引起的實驗室感染事件出現了第三代感染，9人緻病1人死亡，造成了極大的負面影響，引起了國家高度重視。在2004年7月8日的衛生部電視電話會議上，高強副部長通報了這起事件的處理決定，認為是一個應該避免而沒有避免的重大責任事件，以當時的管理狀态發生事故是必然的過程。從此啟動了我國的實驗室生物安全管理體系建設工作。在實驗室管理中人們通常隻關注檢測質量的管理，忽視安全、特别是生物安全的管理。這是因為人們普遍認為實驗室不太可能發生感染，即使感染也沒有很嚴重的後果。這種觀點是錯誤的，雖然從事高緻病性病原微生物研究的實驗室不多，但實驗室感染是客觀存在的現象。直接和緻病性或高緻病性病原微生物打交道，本身就存在風險。如傷寒是實驗室感染中比較嚴重的腸道傳染病，第一次報道在1893年，到1978年共報告了258例，其中20例死亡。1951年報告了153例肺結核感染，其中有25例與實驗室工作有關。由細菌引起的實驗室感染尚有多種疾病，如白喉、痢疾、霍亂、鼠疫、炭疽和流腦等。1976年報告的3921例實驗室感染中，細菌及螺旋體感染占1669例。有些是新發現的病原微生物，一旦具有緻病性由于人們缺乏防範意識将極具感染風險，如八十年代的艾滋病病毒。有些是我們熟悉的微生物，在原先的觀念中對人無緻病力或低緻病力，現在受到環境的影響發生變異，演化為高緻病性或緻病性較強的病原，如人禽流感病毒、冠狀病毒、豬鍊球菌等。

近年來我國和世界各地發生了多起影響較大的傳染病疫情，如人高緻病性禽流感、豬瘟和手足口病等。禽流感以前隻在禽類中傳播，如新疆地區2007年11月發生的高緻病性禽流感疫情共撲殺各類家禽32.25萬隻（羽），現在變成了人高緻病性禽流感，頻繁使人類緻病，中國衛生部追溯診斷2003年11月底的一個不明原因發熱、肺炎病例為人感染高緻病性禽流感(H5N1)确診病例。這是中國大陸目前已知最早的經實驗室确診的人禽流感病例，也是在當前這一輪禽流感疫情中全球發現最早的人禽流感病例。根據世界衛生組織和中國關于人感染高緻病性禽流感病例診斷标準的規定，自2005年11月16日以來，中國已通報25例人感染禽流感病例，其中13例死亡。據世界衛生組織統計，至今禽流感在全球已導緻340多人感染，其中160多人死亡。豬瘟也是曆史上常見的動物疾病，2005年6月發生在四川的豬鍊球菌疫情卻發生人類感染，分布在資陽等32個縣（市、區），還擴散到廣東等地。累計感染人數達200多人，并造成驚人的38人死亡。手足口病由腸道病毒-71型(EV71)或柯薩奇病毒A16型(CoxAl6)）引起，是嬰幼兒常見傳染病，但山東臨沂市4月發生疫情，緻1260多人發病，3人死亡。還有許多報道都顯示許多常見病原發生了明顯的變異，産生新的緻病能力。如果沒有建立有效的管理體系，實驗室感染等意外将不可避免。

四、實驗室生物安全管理

北京實驗室SARS冠狀病毒感染事件調查結論：跨專業從事實驗研究，腹瀉病研究室研究呼吸道病原；研究人員未經專項培訓，滅活方法未經論證，未建立健康監測制度；生物安全實驗室選擇不當，防護等級不足；生物安全櫃等專用設備未啟用，未按适當的程序和方法進行操作，操作人數不足；未執行實驗室管理制度。

調查結論的核心問題就是規章制度。有無制訂實驗室生物安全管理的各項規定，規定是否合理、完善，規定是否被認真執行，規定在執行中是否被曲解，都直接影響到實驗室生物安全管理的有效性。幾年來，國務院頒發了第424号令《病原微生物實驗室生物安全管理條例》和第380号令《醫療廢物管理條例》，衛生部、環保總局、建設部、國家質量監督檢驗檢疫總局和國家标準化管理委員會等國家相關部門出台了《可感染人類的高緻病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定》、《病原微生物實驗室生物安全環境管理辦法》、《生物安全實驗室建築技術規範》、《實驗室生物安全通用要求》等一系列文件和技術标準，為實驗室生物安全管理體系建設打下了堅實的基礎。法律法規和各項生物安全規定要落實到每個實驗室，需要建立完善的管理體系。

實驗室生物安全管理體系分為室間和室内兩個管理體系。

室間為實驗室生物安全行政管理架構，由省衛生廳牽頭，聯合省科技廳、省教育廳、省質檢局、省農業廳等部門協同管理。建立成立省級專家隊伍；編制全套生物安全管理法規文件；建立監督管理體系和檢查評估體系；建立BSL-2實驗室和BSL-3實驗室管理模式。擔負傳染病防控任務的衛生部門是實驗室生物安全管理的重點，各級衛生行政主管部門要建立實驗室生物安全行政管理體系；實施實驗室備案，開展各項實驗活動，如檢測活動、高緻病性病原微生物菌（毒）種及樣本的運輸、科研項目生物安全審查、生物材料出入境審批等工作；組織基本面調查、監督和檢查。

室内指實驗室設立單位建立的實驗室生物安全管理體系，從單位的層面全面開展涉及病原所有工作的管理。成立生物安全管理委員會、設立管理辦公室，建立監督員、内審員隊伍；制訂生物安全管理體系文件；建設标準化的、适合工作需要的生物安全實驗室；開展系統培訓；實施各項管理活動；建立健康監測機制。各個實驗室則負責配備、使用和管理相适應的生物安全設施、設備和物品；控制樣品流轉；做好實驗室準入、特殊活動審批、個人防護、廢棄物處置和應急等工作。

五、實驗室生物安全相關概念

1.生物因子(bio-agents):具有一定生物活性的物質，或來源于活生物的物質,包括生物體本身。

2.微生物（microbes, microorganisms）:微生物是指活的生物因子，包括能夠複制或基因物質傳遞的細胞或非細胞的微小生物實體，其中包括緻病和非緻病的微生物。主要指細菌（螺旋體、立克次體、衣原體）、真菌、病毒和某些寄生蟲。

3.病原體（pathogens）:病原體是能緻病的生物因子，包括能夠引發人和動物、植物傳染病的生物因子，主要指緻病微生物。按危害程度分為四類：

（1）一類病原微生物

高個體危害，高群體危害臨床表現起病迅速，病程短，病情嚴重，病死率高，通常導緻個體死亡，或者痊愈之後有嚴重的後遺症。這類疾病可能傳播的途徑多，傳播速度快，動物與人之間的傳播十分普遍，或者人與人之間的傳播，人群普遍易感。這類病原體的實驗室操作應該在BSL－3級或者以上級别的實驗室進行。

（2）二類病原微生物

高個體危害，低群體危害臨床表現起病迅速，病程短，病情嚴重，病死率高，通常導緻個體死亡，或者痊愈之後有嚴重的後遺症。這類疾病傳播速度比第一類要慢，動物與人之間的傳播比較普遍，也存在人與人之間的傳播，人群普遍易感。但是流行的範圍沒有第一類廣泛，病死率可能比第一類要低。這類病原體的實驗室操作應該在BSL－3級進行。

（3）三類病原微生物

中等個體危害，有限群體危害臨床表現起病較快或者潛伏期比較長，起病之後病情不嚴重，病死率低，一般不導緻個體死亡。這類疾病可能傳播的途徑多，傳播速度慢，存在人與人之間的傳播，僅僅在局部流行，有藥物可以使用。這類病原體的實驗室操作應該在BSL－2實驗室進行。

（4）四類病原微生物

低個體危害，低群體危害一般情況下，這類病原體不會引起個體和群體的感染，個體感染後可能出現臨床症狀，也可能出現隐性感染沒有任何臨床症狀。起病後症狀較輕，有治療的藥物使用，經過治療後可以痊愈，一般不會留下後遺症。這類疾病可能傳播的途徑有限，人群普遍具有抵抗力。這類病原體的實驗室操作在BSL－1級實驗室進行。

4.生物危害(bio-hazard)和生物危險(bio-risk)：生物危害是由生物因子形成的傷害；生物危險(bio-risk)是生物因子将要或可能形成的危害，是傷害概率和嚴重性的綜合。

5.危險廢物（hazardous waste）：即有潛在危險的廢物，即可燃、易燃、腐蝕、有毒、傳染、放射或其他破壞作用的廢物

6．生物威脅(bio-threat)：是指生物因子形成的使人憂慮的、可能發生的嚴重危害。

7.生物氣溶膠(bio-aerosol)：氣溶膠是指懸浮于氣體介質中粒徑一般為0.001-100μm的固态或液态微小粒子形成的相對穩定的分散體系。在分散相中含有生物因子的氣溶膠。8.生物戰劑(agent of bio-war,):戰場上使用含有病原體的物質。

9.生物戰劑氣溶膠(bio-agent aerosol)：分散相含有生物戰劑的氣溶膠。氣溶膠噴灑是國外生物戰釋放生物戰劑的主要方式。

10．生物戰（bio-war）：是指用生物戰劑進行的戰争。目前世界發達國家的生物武器相當先進，武器化能力很強；一些第三世界國家也掌握了生物武器，被稱為窮人的原子彈；一旦使用，造成的災難不可設想。國内外有關專家認為發生生物戰的潛在危機正在增加，令人憂慮。

11．基因武器（gene weapon）：指用基因工程研制的生物武器。 現代生物技術的發展一方面為人類造福，另一方面也會被人利用發展武器。現代生物技術能改變生物戰劑的攻擊性能，改變其抗原性使之難以診斷；增強其緻病性以加強殺傷力；增強其存活力以延遲攻擊時間和擴大攻擊面積；增強其抗藥性造成治療困難；改變其基因特性形成基因武器。專家推測，基因武器能夠進行對人種的特異性攻擊。

12．實驗室相關感染(laboratory-associated infection)：由于從事實驗活動而發生的與操作的生物因子相關的感染。在研究病原微生物中存在某種風險，如果在管理和操作病原體中一旦有所疏漏或錯誤就會發生實驗室感染，造成威脅，進而可能造成病原體擴散或傳染病的流行。

13．醫院感染(hospital-acquired infection)：醫院感染也叫醫院獲得性感染或院内感染,指在醫院内發生的一切感染。

14.人畜共患病(zoonosis):人和動物間相互傳播的傳染病。人的傳染病常常由動物傳播,可通過接觸經皮膚和粘膜感染,也可經消化道進入體内,更可通過氣溶膠經呼吸道感染。

15．外來病(exotic disease)：國外存在和流行的，國内尚未證實存在或已被消滅的傳染病。

16．傳染病（communicable disease）:是指由各病原體引起的一組具有傳染性的疾病。已有的一些烈性傳染病還沒有有效的預防和控制，已經控制的一些傳染病有死灰複燃的勢頭，新的傳染病不斷出現，是我們面臨挑戰 。

17．突發公共衛生事件(emergent events of health)：（簡稱突發事件），是指突然發生，造成或者可能造成社會公衆健康嚴重損害的重大傳染病疫情、群體性不明原因疾病、重大食物和職業中毒以及其他嚴重影響公衆健康的事件。突發公共衛生事件的危害性和破壞性是多方面的，不僅危害公衆身體健康和生命安全、造成公衆心理恐懼，甚至導緻社會混亂、經濟衰退，威脅國家安全。

18．食源性傳染病（food borne infectious）：指通過飲食媒介經消化道感染的疾病。2000年第53屆世界衛生大會上，世界衛生組織将食品安全列為重要議題，并指出食源性疾病與食品污染是不斷擴大的公共衛生問題。在過去的20年裡，食源性疾病的發生率明顯上升。在發達國家，估計每年有1/3以上的人群感染食源性疾病。美國每年約有7000萬～8000萬人患食源性疾病，其中32.5萬人入院治療，5000人死亡。

19.實驗室生物安全:指為了避免各種有害生物因子造成的實驗室生物危害而采取的防護措施（硬件）和管理措施（軟件）。國家标準《實驗室生物安全通用要求》對生物安全的定義是避免危險生物因子造成實驗室人員暴露、向實驗室外擴散并導緻危害的綜合措施。

20.生物安全實驗室：具備生物安全防護能力的實驗室，分為4級。

六、生物安全防護

1.實驗室生物安全防護的類型：

一級防護（隔離）(primary barriers)：包括兩方面内容：

（1）生物安全櫃(biological safety cabinet, BSC)和類似的設備等，生物安全櫃是直接操作危險性微生物時所用的箱形安全設備，是生物安全實驗室必備的裝備，分成三個級别。一級生物安全櫃沒有正面遮擋保護，進生物安全櫃的風速較低，不能保護樣本，對實驗人員和環境的保護能力有限；二級生物安全櫃正面有超過2/3遮擋保護，進生物安全櫃的風速較高，能夠有效保護樣本、實驗人員和環境，按排氣量的多少又分為4個型号，應根據工作類型選擇匹配的型号；三級生物安全櫃正面為全遮擋保護，進生物安全櫃的風速較高，對樣本、實驗人員和環境均有非常可靠的保護。

（2）個人防護裝備(personal protective equipment, PPE)，也分成三個級别。一般防護，工作服、手套即可；嚴格防護，使用專用防護服，盡量遮蓋暴露皮膚、口鼻等部位；嚴密防護，遮蓋所有暴露皮膚和面部器官，隻要可能，盡量使用兩層以上防護裝備但不妨礙操作和行動。

脫卸個人防護裝備的順序是：外層手套→防護眼鏡→防護服→口罩帽子→内層手套。

二級防護（屏障）(secondary barriers):是指實驗室屏障設施，其建設有4種不同的結構标準。

2.實驗室生物安全防護的等級：各種一級防護和二級防護的組合，加上合适的管理措施構成不同防護級别的生物安全實驗室。

七、生物安全實驗室建設和管理原則

堅持八項基本原則，即科學合理、安全首位、軟件在先、管理嚴格、遠離病原、預防為主、使用方便和厲行節約，傳染性和緻病性再強的病原微生物,隻要它不和人體接觸，感染就不會發生。隔離、過濾、消毒滅菌和采用個人方式措施均是有效生物安全防護手段。一定要按照國務院發布的《病原微生物實驗室生物安全管理條例》進行管理，盡可能少接觸病原體或少進實驗室。在實驗前對設施、設備進行常規檢測，在實驗過程中進行安全監測，在實驗後對人員實施健康檢測、對環境進行洩漏檢測和消毒效果監測。

八、實驗室生物安全管理體系

1.實驗室生物安全管理體系：

建立方針和目标，并建立組織、程序、過程和資源實現既定的目标。确保每個生物醫學檢測和相關人員熟知生物安全知識，熟練掌握操作技能；确保防護設備和防護用品的供應；确保實驗室工作人員不受實驗對象侵染；确保周圍環境不受緻病微生物的污染；确保緻病性病原微生物的樣品或菌（毒）種不會遺失或被偷竊。為實現目标，必須設立專門的機構，制訂完善的體系文件，按規定的要求做好各項防護措施，按既定的計劃實施各項管理、監督和檢查工作。

2．生物安全組織結構：

成立生物安全委員會、設立日常管理辦公室、建立生物安全員隊伍。規定實驗室生物安全機構、管理組織和相關部門、相關成員的權力、義務和職責。規定領導部門、監管部門、執行部門、支持部門之間的關系。繪制組織結構框圖。有可靠的代理機制和溝通機制。

3.生物危害性評估

生物安全操作的核心是危害評估。由實驗室最熟悉所要操作的微生物的特性、所使用的實驗和防護設備、實驗程序和政策的技術人員進行。評估應充分、及時、準确。應公告、制度化并能适時更新。

4.生物安全體系文件

體系文件由實驗室生物安全管理手冊、程序文件、安全手冊、生物危害性評估、SOP和表格等文件組成。管理手冊是對本單位實驗室生物安全管理總的原則性描述，包括生物安全所有要素。通常以國際标準ISO15189-2003為基礎，結合我國生物安全相關法律法規的要求制訂，适用于整個單位和領導層使用，是第一層次的文件。程序文件通常指各方面具體的規章制度，為管理手冊的支持性文件，适用于單位内部各實驗室、各部門使用，為第二層次的文件。SOP為标準操作規程，也稱作業指導書，通常針對每項具體的活動、每個崗位、每台設備，由每個從事實驗室活動的人員所使用，為第三層次的文件。表格為體系運行過程中技術和管理方面為記錄而設立的文件，可為運行提供證據，是第四層次的文件。

體系文件可以三層或四層，依實際情況而定，程序文件可以并入管理手冊或SOP。實驗室生物安全管理體系文件形成後，應通過有效文件或在正式場合宣布生效，廣泛宣貫并要求本單位生物安全相關部門、機構和個人必須遵守體系文件的各項規定。重要的文件、技術規範要編制發放清單，建立領取登記、借閱等制度，必要時還應進行遺失登記，保持文件的現行有效性。應将各類生物安全文件系統地收集、裝訂成冊。

5．人員管理

應選派本單位實驗室生物安全管理和檢測人員到上級或相關部門參加專項培訓、專業進修等，實時舉辦全員培訓，讓所有相關人員深刻理解國家有關實驗室生物安全的法律法規、技術規範和行政規定，特别是本單位的實驗室生物安全管理體系文件。建立每位工作人員的健康檔案，及時針對工作對象采取相應的免疫或防護措施。

6.設備管理

設備管理的目的是保證設備的質量和運行中的可靠性。在采購時要追求質量，在安裝時要保持性能，在使用前應制訂操作SOP和維護計劃，在使用時要規範操作。建立管理檔案、使用标識、及時記錄和适時驗證。

BLS-2實驗室安全設備一般包括:Ⅱ級生物安全櫃;高壓滅菌器;洗眼器。BSL-2實驗室應設置洗手池，但不能裝配手動式的水龍頭；生物安全儀器設備在運行前必須進行經過合格檢查并具有狀态标識；實驗室應具備一定的安全防護能力，必須配備閉門器；每個實驗室應有洗手池，洗手池宜設置在靠近實驗室内近門處；BSL-2實驗室内使用過的防護服不得穿出實驗室；按照《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2004）的要求，BSL-2實驗室應有“洗眼器”裝置；

7.樣品流程控制

樣品的整個流程從獲得開始直至消除的全過程應有控制措施和記錄（可以整批），每個流轉環節必要時應審批。未知病原微生物按生物安全二級防護進行操作。在包裝時應确保包裝材料的牢固性、密閉性和安全性。在運輸時要注意樣本的質量和防護，如果懷疑是高緻病性生物材料時還要申請審批。在交通工具、運輸人員、包裝方式等符合相關的規定。在傳播、接收、保藏和處置樣本時也應規範操作，特别是菌（毒）種管理要建立完善的管理制度，設立專門的保管人員、選擇合适的場所、使用專用的保藏設備和采取适當的防護措施來保證菌（毒）種的安全。

8．生物安全二級實驗室

生物安全二級實驗室是涉及病原微生物操作的最低條件。當操作人體材料時，隻要可能含有病原微生物，原則上都應在生物安全二級實驗室中進行。實驗室為普通建築物即可，但盡量設計在人員走動較少的地方或走廊的盲端。布局應合理有序，人流、物流清晰，有足夠的空間，清潔區和污染區有一定的區分，嚴禁實驗區與辦公區混雜，建立實驗室準入門檻，張貼警示标志、安裝自動閉門器，安裝牢固的門窗。每個實驗室應設洗手池，宜設置在進出口處。實驗室光線充足不晃眼、宜自然通風，但窗戶應使用紗窗。應設計控制昆蟲和齧齒動物進入的屏障，保證下水道、門、窗及各種電器或設備管道的密閉性。

應做好個人防護，配置生物安全櫃等防護設備和器械，要求實驗室就近有壓力蒸氣滅菌器。有可靠的電力供應和應急照明，制訂應急救治預案，裝備應急救治物品，實驗室的門設有可視窗，出口有發光指示标志，标明撤離路線，應配備适量的消防器材，設洗眼設施，必要時可安裝應急噴淋裝置，保證安全。

9．内務管理

實驗室對人員的準入依照不同生物安全防護等級分别進行限制。與實驗無關或妨礙實驗的物品或設備不放置在實驗室，實驗室内的人員數量或無關人員的出入予以限制，一切與實驗無關的行為或工作予以禁止。在實驗時應卸掉各種妨礙操作和帶來危險的佩戴物。無論是否戴手套，隻要接觸感染性材料或潛在的危險，應及時洗手，并使用感應等非手動的水龍頭。廢氣、廢物、廢水應滿足環保的要求，交由具備資質的專業機構處理。還要防止有害的生物體在滅活之前移出實驗室。廢棄物應分類存放，對銳器應有防護。可重複使用器械回收應滅菌、清潔，徹底去除污染病源微生物。