消毒和滅菌

消毒和滅菌的基本常識對于實驗室生物安全是至關重要的。由于嚴重污染的物品不能迅速地消毒或滅菌，因此了解預清潔的基本原理也同樣重要。關于消毒和滅菌，以下基本原則适用于所有已知不同級别的微生物病原體。

關于清除污染的特殊要求，要根據實驗工作的類型以及所操作的感染性物質的特性來決定。這裡所提供的一般性資料，可用于建立标準的和更專門的程序，以處理特定實驗室中所涉及的生物危害。消毒劑的作用時間因具體的品種和生産商而不同。因此，所有消毒劑使用的推薦意見均必須遵守生産商的說明。

一、定義

關于消毒和滅菌有許多不同的術語，下面是生物安全中較常用的：

抗菌劑（antimicrobial）能夠殺死微生物或抑制它們生長和繁殖的制劑。

防腐劑（antiseptic）能夠抑制微生物生長和繁殖但不足将其殺滅的物質。防腐劑經常應用于體表。

生物殺滅劑（biocide）所有能夠殺死生物體的制劑的統稱。

化學殺菌劑（chemicalgermcide）用于殺死微生物的化學品或化學混合物。

清除污染（decontamination）去除和／或殺死微生物的任何過程。該詞也用于去除或中和有危害的化學品和放射性物質。

消毒劑（disinfectant）用于殺死微生物的化學品或化學混合物，但不一定殺死其孢子。消毒劑常用于非生命物體或其表面。

消毒（disinfection）殺死微生物的物理或化學手段，但不一定殺死其孢子。

滅菌劑（microbicide）能夠殺死微生物的化學品或化學混合物。該詞常常可以代替“生物殺滅劑”、“化學殺菌劑”或“抗菌劑”。

殺孢子劑（sporocide）用于殺死微生物和孢子的化學品或化學混合物。

滅菌（sterilization）殺死和／或去除所有微生物及其孢子的過程。

二、實驗室材料的清潔

清潔是指去除污垢、有機物和污漬。清潔方法包括刷、吸、幹擦、洗滌或用浸泡肥皂水或清潔劑的濕墩布拖擦。塵土、污物以及有機物是微生物的栖身之所，并可能影響除污染劑（抗菌劑、化學殺菌劑以及消毒劑）的殺菌作用。

必須通過預清潔才能實現消毒和滅菌的目的。許多殺菌劑隻對經過預清潔的物品才具有殺菌活性。預清潔時必須小心，以避免暴露于感染性物質。

預清潔時必須使用與以後使用的殺菌劑化學上相容的物質。非常普遍的是采用相同的化學殺菌劑進行預清潔和消毒。

三、化學殺菌劑

多種化學品可以用作消毒劑和∕或防腐劑。由于其數量與種類還在不斷增加，因此，要根據具體的用途認真選擇。許多化學品在較高溫度時其殺菌效果更快也更好。但同時，較高的溫度能夠加速其揮發和降解。因此在熱帶地區，由于室溫較高，可能縮短化學殺菌劑的有效期，在使用和儲存這些化學品時要特别注意。

許多殺菌劑對人或環境有害，應當按生産商的說明小心地進行選擇、貯存、操作、使用和廢棄。為了個人的安全，建議在稀釋化學殺菌劑時應戴手套、圍裙和保護眼睛的器具。

化學殺菌劑一般不用于地面、牆壁、設備和家具的常規清潔。但是，在控制疾病暴發時可以使用。正确使用化學殺菌劑可以确保實驗場所的安全，減少來自感染性物質的危險。隻要可能，出于經濟原因、控制庫存以及限制環境污染等的考慮，應盡可能控制所使用化學殺菌劑的量。

下面介紹一些常規使用的化學殺菌劑，并列出它們的一般用途和安全特征。除非另外标注，殺菌劑的濃度用重量／體積（w/v）來表示。表12彙總了含氯消毒劑的推薦使用濃度。

表12 含氯消毒劑的推薦使用濃度

氯（次氯酸鈉）

氯屬于快速作用的氧化劑，是一種可廣泛應用的廣譜化學殺菌劑。它一般以次氯酸鈉（NaOCl）溶液來作為漂白劑銷售，使用時可以用水稀釋成各種不同的有效氯濃度。氯（尤其用作漂白劑時）是強堿性的，能夠腐蝕金屬。有機物（蛋白質）會顯著減弱其活性。如果在開口容器中儲藏高濃度的或使用濃度的漂白劑，尤其在高溫條件下，會釋放氯氣而減弱其殺菌能力。要根據漂白劑工作液的初始濃度、容器的類型（如有無蓋子）和大小、使用的頻率和特性以及室内條件，來确定它們的更換頻率。一般而言，對于那些需要一天多次浸泡處理含有高濃度有機物的材料的漂白劑溶液，應當至少每天更換一次，而那些使用頻率較低的漂白劑溶液，則可以維持一周時間。

常規實驗室消毒劑的有效氯濃度應為1g/L。推薦使用含有5g/L有效氯的更強作用的溶液來處理生物危害性物質的溢出以及含有大量有機物的情況。作為家用漂白劑的次氯酸鈉溶液含有50g/L的有效氯，因此分别需要進行1﹕50或1﹕10的稀釋來達到終濃度1g/L和5g/L。工業用漂白劑的次氯酸鈉溶液含有近120g/L的有效氯，必須進行相應的稀釋來達到上述濃度。

次氯酸鈣［Ca（ClO）2］的顆粒或片劑一般含有70%的有效氯。用顆粒或片劑配制濃度1.4g/L或7.0g/L的溶液，其有效氯濃度分别為1.0g/L和5g/L。

不建議将漂白劑當作防腐劑使用，但可以用作普通目的的消毒劑以及用于浸泡非金屬類的污染材料。在緊急情況下也可以用終濃度含1～2mg/L有效氯的漂白劑來消毒飲用水。

氯氣具有強毒性。因此漂白劑隻能在通風良好的地方儲存和使用。另外，漂白劑也不能與酸混合以避免氯氣快速釋放。氯的許多副産物可能對人體及環境有害，應該避免濫用含氯消毒劑，特别是漂白劑。

二氯異氰尿酸鈉

二氯異氰尿酸鈉（NaDCC）的粉劑含有60%的有效氯。用NaDCC粉劑配制的濃度為1.7g/L和8.5g/L的溶液将分别含有1g/L和5g/L的有效氯。NaDCC片劑一般每片含有1.5g的有效氯，将1片或4片溶于1升水将分别獲得濃度約為1g/L和5g/L的溶液。粉劑或片劑的NaDCC儲存既方便又安全。血液或其他生物危害性液體溢出時，可以使用固體NaDCC，并使其作用至少10min後再除去，然後對污染區進行進一步的清理。

氯胺

氯胺粉劑含有大約25％的有效氯。氯胺釋放氯的速度比次氯酸慢，因此如果需要獲得同次氯酸相同的效力，就需要較高的初始濃度。另一方面，有機物對氯胺溶液的影響沒有次氯酸溶液那麼大，在“清潔”和“污染”情況下都推薦使用20g/L的濃度。氯胺溶液實際上無臭味。但是，浸泡在氯胺中的物品必須要徹底清洗，以除去加入到氯胺-T（甲苯磺酰氯醛甲酰胺鈉）粉劑中的填充劑的殘留物。

二氧化氯

二氧化氯是一種高效的快速殺菌劑、防腐劑和氧化劑。經常有報道，認為其在濃度低于漂白粉的含氯濃度時即具活性。二氧化氯作為氣體是不穩定的，将分解為氯氣（Cl2）和氧氣（O2），并放熱。然而，二氧化氯溶于水，并在水溶液中穩定。有兩種方法可獲得二氧化氯：（1）将鹽酸（HCl）和亞氯酸鈉（NaClO2）兩種單獨成分混合時即可生成；（2）訂購其穩定态，然後在需要時随時活化生成。就氧化殺菌劑而言，二氧化氯是高選擇性的氧化劑。臭氧和氯比二氧化氯有更高的反應活性，能氧化大多數的有機物。然而，二氧化氯僅同還原性硫化物、仲胺、叔胺以及其他強還原性和反應活性的有機物作用。因此，與使用氯和臭氧相比，二氧化氯在含量低得多的情況下，能得到更穩定的反應産物。在有機物較多的情況下，由于其選擇性，使用适量的二氧化氯比臭氧和氯更有效。

甲醛

在溫度高于20℃時，甲醛（HCHO）是一種能夠殺死所有微生物及其孢子的氣體。但甲醛對朊蛋白沒有殺滅活性。

甲醛起效相對較慢，并需要相對濕度達70％左右。市場上出售的産品為多聚甲醛——一種固體多聚體，呈薄片狀或小塊狀——一種濃度約為370g/L（37％）的氣體水溶液，其中含甲醇（100mL/L）作為穩定劑。兩種形式加熱都可以産生氣體，用于封閉空間（如生物安全櫃和房間）的清除污染和消毒（見本章“清除局部環境污染”部分）。甲醛（5％水溶液）可以作為液體消毒劑。

甲醛被懷疑是一種緻癌劑。它具有刺鼻的氣味，其氣體能夠刺激眼睛和黏膜，因此必須在通風櫥或通風良好的地方儲存和使用。必須遵守國家化學品安全規定。

戊二醛

像甲醛一樣，戊二醛［OHC（CH2）3CHO］也對繁殖的細菌、孢子、真菌和含脂或不含脂的病毒具有活性。它不具有腐蝕性，比甲醛作用迅速，但也需要幾個小時才能殺死細菌孢子。

通常所供應的戊二醛是濃度約20g/L（2％）的溶液，絕大部分産品使用前需要加入與産品一同提供的碳酸氫鹽混合物進行“活化”（變成堿性）。活化的溶液根據其配方設計、應用類型和使用頻率等情況可以重複使用1～4周。與有些産品一同提供的指示計（dipstick）僅用于粗略指示溶液中的活性戊二醛水平。如果戊二醛溶液變混濁，就應當将其廢棄。

戊二醛具有毒性，并對皮膚和黏膜具有刺激性，應當避免與其接觸。必須在通風櫥或通風良好的地方使用。不建議采用其噴霧劑或溶液來清除環境表面的污染。必須遵守化學品安全的國家規定。

酚類化合物

酚類化合物是一大類最早使用的殺菌劑。但是，最近出于安全考慮而限制了它的使用。它們對繁殖細菌和含脂病毒具有活性，适當配制後，對分枝杆菌也有活性。它們對孢子沒有活性，而對于非含脂病毒的活性則不确定。許多酚類産品可用于清除環境表面的污染，有些（如三氯生和氯二甲酚）是最常用的抗菌劑。

三氯生常作為洗手用品。它主要對繁殖的細菌有活性，并且對皮膚和黏膜是安全的。但是，實驗研究發現，對低濃度三氯生具有耐受性的細菌對某些抗生素也有耐受性。該領域中這一發現的意義還不清楚。

有些酚類化合物對水的硬度敏感，并可能導緻失活，因此必須使用蒸餾水或去離子水來進行稀釋。

不建議在食物接觸的表面和幼兒活動場所使用酚類化合物。它們可能被橡膠吸收，也可能滲透皮膚。必須遵守國家化學品安全規定。

季铵鹽類化合物

季铵鹽類化合物大多混合使用，也經常與醇類等其他殺菌劑聯合使用。季铵鹽類化合物對繁殖的細菌和含脂類病毒具有良好活性。某些類型（如苯紮氯铵）也用作防腐劑。

有些季铵鹽類化合物的殺菌作用會受有機質、水的硬度以及陰離子去污劑的顯著影響，因此當使用季铵鹽化合物進行消毒時，要認真選擇預清潔所用的品種。有些具有潛在危害性的細菌能夠在季铵鹽化合物溶液中生長。由于其生物降解能力較低，這些化合物也可能在環境中蓄積。

乙醇

乙醇（C2H5OH）和異丙醇［（CH3）2CHOH］具有相似的滅菌特性。它們對于繁殖的細菌、真菌和含脂病毒具有活性，但不能滅活孢子，而對非含脂病毒的作用則不确定。其水溶液最有效的使用濃度約為70％（v/v）；更高或更低的濃度均不适宜殺菌。醇類溶液的主要優點是處理後物品不會留下任何殘留物。

将乙醇與其他試劑混合使用比單獨使用更有效，如70％（v/v）乙醇和100g/L的甲醛混合使用，以及使用含有2g/L有效氯的乙醇。70%（v/v）乙醇溶液可以用于消毒皮膚、實驗台和生物安全櫃的工作台面，以及浸泡小的外科手術器械。由于乙醇可以使皮膚幹燥，所以經常與潤滑劑混合使用。在不便于或不可能進行徹底洗手的情況下，推薦使用含乙醇的擦手液對輕度污染的手進行消毒。但是必須記住，乙醇對孢子無效，而且不能殺死所有類型的非含脂類病毒。

乙醇是易揮發和易燃的，不能在明火附近使用。其工作液應儲存在适當的容器内以避免醇類揮發。乙醇可以硬化橡膠并溶解某些膠質。為了避免乙醇用于其他非滅菌目的，在實驗室裡對乙醇進行專門的清點和儲存是非常重要的。含有乙醇溶液的瓶子必須清楚标記以避免被意外高壓滅菌。

碘和碘伏

這類消毒劑的作用與氯類似，隻是有機質對它們的抑制作用略弱。碘可以使纖維和環境表面着色，一般不适合作為消毒劑。但是，碘伏和碘酊是很好的抗菌劑。多聚碘（polyvidoneiodine）是一種安全可靠的外科手術擦手劑和手術前皮膚抗菌劑。碘類抗菌劑一般不适于醫療／牙醫器械的消毒。碘不能在鋁或銅上使用。碘有毒性。含有有機碘的産品必須于4～10℃儲存，以避免有潛在危害性的細菌在裡面生長。

過氧化氫和過氧乙酸

像氯一樣，過氧化氫（H2O2）和過氧乙酸（CH3COOOH）是強氧化劑，是一種廣譜殺菌劑。對人和環境它們較氯更為安全。

通常供應的過氧化氫是可以立即使用的3％的溶液，或是用無菌水稀釋5～10倍體積後使用的30％的水溶液。但是，那種單獨含有3～6％過氧化氫的溶液殺菌作用緩慢而有限。現有産品中含有其他成分來穩定過氧化氫，加速其殺菌作用并降低其腐蝕性。過氧化氫能夠用于清除實驗台和生物安全櫃工作台面的污染，較高濃度的溶液适于清除對熱敏感的醫療∕牙醫器械的污染。采用過氧化氫或過氧乙酸熏蒸來消毒對熱敏感的醫療／牙醫器械時，需要特殊的設備。

過氧化氫和過氧乙酸能腐蝕鋁、銅、黃銅和鋅等金屬，也能使纖維、頭發、皮膚及黏膜褪色。經它們處理的物品必須經過徹底的漂洗後才能接觸眼睛和黏膜。它們應當儲存在避熱和避光的地方。

四、清除局部環境的污染

需要聯合應用液體和氣體消毒劑來清除實驗室空間、用具和設備的污染。清除表面污染時可以使用次氯酸鈉（NaOCl）溶液；含有1％有效氯的溶液适于普通的環境衛生設備，但是當處理高危環境時，建議使用高濃度（5g/L）溶液。用于清除環境污染時，含有3％過氧化氫的溶液也可以作為漂白劑的代用品。可以通過加熱多聚甲醛或煮沸所産生的甲醛蒸氣熏蒸來清除房間和儀器的污染。這是一項需要由專門培訓的專業人員來進行的、非常危險的操作。産生甲醛蒸氣前，房間的所有開口（如門窗等）都應用密封帶或類似物加以密封。熏蒸應當在室溫不低于21℃且相對濕度70%的條件下進行（見本章“清除生物安全櫃的污染”部分）。

清除污染時氣體需要與物體表面至少接觸8h。熏蒸後，該區域必須徹底通風後才能允許人員進入。在通風之前需要進入房間時，必須戴适當的防毒面具。可以采用氣态的碳酸氫铵來中和甲醛。采用過氧化氫溶液對小空間進行氣霧熏蒸同樣有效，但需要專門的蒸氣發生設備。

五、清除生物安全櫃的污染

清除Ⅰ級和Ⅱ級生物安全櫃的污染時，要使用能讓甲醛氣體獨立發生、循環和中和的設備。應當将适量的多聚甲醛（空氣中的終濃度達到0.8%）放在電熱闆上面的長柄平鍋中（在生物安全櫃外進行控制）。然後将含有比多聚甲醛多10%的碳酸氫铵置于另一個長柄平鍋中（在生物安全櫃外進行控制）。在櫃外将該平鍋放置到第二個加熱闆上，在安全櫃外将電熱闆接上插頭通電，以便需要時在櫃外通過開關電源插頭控制盤子的操作。如果相對濕度低于70％，在使用強力膠帶［如管道膠帶（ducttape）］密封前部封閉闆前，還要在安全櫃内部放置一個開口的盛有熱水的容器。如果前部沒有封閉闆，則可以用大塊塑料布粘貼覆蓋在前部開口和排氣口以保證氣體不會洩漏進入房間。同時供電線穿過前封閉闆的穿透孔須用管道膠帶密封。

将放有多聚甲醛平鍋的加熱闆插上插頭接通電源。在多聚甲醛完全蒸發時拔掉插頭以斷電。使生物安全櫃靜置至少6h。然後給放有第二個平鍋的加熱闆插上插頭通電，使碳酸氫铵蒸發。然後拔掉電插頭，接通生物安全櫃電源兩次，每次啟動約2秒鐘來讓碳酸氫铵氣體循環。在移去前封閉闆（或塑料布）和排氣口罩單前，應使生物安全櫃靜置30min。使用前應擦掉生物安全櫃表面上的殘渣。

六、洗手／清除手部污染

處理生物危害性材料時，隻要可能均必須戴合适的手套。但是這并不能代替實驗室人員需要經常地、徹底地洗手。處理完生物危害性材料和動物後以及離開實驗室前均必須洗手。

大多數情況下，用普通的肥皂和水徹底沖洗對于清除手部污染就足夠了。但在高度危險的情況下，建議使用殺菌肥皂。手要完全抹上肥皂，搓洗至少10秒鐘，用幹淨水沖洗後再用幹淨的紙巾或毛巾擦幹（如果有條件，可以使用暖風幹手器）。推薦使用腳控或肘控的水龍頭。如果沒有安裝，應使用紙巾或毛巾來關上水龍頭，以防止再度污染洗淨的手。如上所述，如果沒有條件徹底洗手或洗手不方便，應該用酒精擦手來清除雙手的輕度污染。

過濾除菌操作的正确順序是： 使用前，将濾器和過濾瓶等全部裝置用紙包好經高壓滅菌;使用時，在無菌操作條件下将濾器安裝到過濾瓶上;用橡皮管以無菌操作将過濾瓶、安全瓶、壓差計和抽氣系統連接;将待過濾液體注入濾器過濾，時間不宜過長，壓力控制在100-200mmHg為限；過濾除菌操作時,将菌液注入濾器過濾，時間不宜過長，壓力控制在100～200mmHg為宜。

七、熱力消毒和滅菌

加熱是最常用的清除病原體污染的物理手段。“幹”熱沒有腐蝕性，可用來處理實驗器材中許多可耐受160℃或更高溫度2～4h的物品。幹熱滅菌是利用熱的作用來殺菌，通常在烘箱；幹熱滅菌效果監測應采用枯草杆菌玄色變種芽孢作生物指示。物燃燒或焚化（見下）也是一種幹熱方式。高壓滅菌的濕熱法則最為有效。

煮沸并不一定能殺死所有的微生物或病原體，但如果其他方法（化學殺菌、清除污染、高壓滅菌）不可行或沒有條件時，也可以作為一種最起碼的消毒措施。滅菌後的物品必須小心操作并保存，以保證在使用之前不再被污染。

使用高壓滅菌器時:滅菌器腔内裝載要松散，以便蒸汽作用均勻;滅菌器的排水過濾器應經常拆下清洗;待溫度降至80℃以下時才能打開。高壓蒸汽滅菌是對實驗材料進行滅菌的最有效和最可靠的方法，确保正确滅菌的條件是121℃、滅菌15分鐘而幹熱滅菌使用溫度和時間通常為160-400℃，1-5h；采用熏蒸法滅菌，熏蒸過程至少密閉保持12h；液體和固體物品分開存放。

被病原微生物污染的玻璃器皿，應先放在高壓滅菌鍋中進行消毒滅菌。用玻璃（細菌）濾器過濾含傳染性物質時，應先在2%的石炭酸溶液中至少浸泡2h，然後再洗滌、高壓滅菌。

濕熱滅菌較幹熱滅菌消毒效果更好，使用也較普遍;使用濕熱滅菌時，蛋白質在含水多時容易變性，易于凝固;使用濕熱滅菌時，蒸汽具有潛熱，當蒸汽與被滅菌的物品接觸時，可凝結成水而放出潛熱，使溫度迅速升高，加強滅菌效果。

八、紫外線殺菌

紫外線消毒方便實用，紫外燈可以是固定式，也可以是活動式的，但離被照射物不應超過1.2M，開啟的紫外燈時不可以在紫外燈下工作。紫外線消毒時不能同時開啟日光燈和紫外燈；紫外線消毒方便實用，但不能徹底滅菌，特别是對細菌的芽孢殺滅效果較差。